多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩端互補(bǔ)，經(jīng)55℃低溫退火，引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。在72℃條件下，結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補(bǔ)配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經(jīng)過20-30個周期后，特異的目的DNA可擴(kuò)增百萬倍以上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴(kuò)增條帶。
PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物及寄生蟲的檢測。
PCR方法檢測病原微生物
【材料】
1．無菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠
2．10×PCR反應(yīng)緩沖液
3．25mmol dNTP混合液
4．引物1，引物2各50pmol／u1
5．模板DNA
6．5U／ul Taq DNA聚合酶
【儀器】
1．PCR擴(kuò)增儀
2．電泳儀
3．紫外線分析儀
【方法】
1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
10×PCR反應(yīng)緩沖液 5u1
引物1 2ul
引物1 2ul
模板DNA 10u1
dNTP混合液 4ul
Taq DNA聚合酶 1ul
無菌雙蒸水 加至 50ul
混勻, 加50 ul石蠟油，防止樣品水分蒸發(fā)。
2．將反應(yīng)管置于PCR儀中，94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。
3．反應(yīng)完成后，取l0ul PCR擴(kuò)增液，加至2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓100V，電泳30~60min后，置紫外線分析儀下觀查擴(kuò)增結(jié)果。